Quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật ELISA tìm ký sinh trùng mèo Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii là một ký sinh trùng ban đầu được phân lập vào năm 1908 từ một động vật gặm nhấm Bắc châu Phi, trong đó găọ nhiều nhất ở con mèo. Kể từ đó, các sinh vật đã được tìm thấy ở nhiều loài chim, bò sát và động vật có vú. Ở đây dân gian thường gọi là ký sinh trùng mèo.

Con người bị nhiễm Toxoplasma gondii từ nhiều nguồn nghi ngờ khác nhau: ăn phải thịt bị nhiễm bệnh, đặc biệt là thịt cừu và thịt lợn, hoặc ăn phải rau dính đất bị nhiễm kí sinh trùng mèo. Toxoplasmosis bẩm sinh là một bệnh với một loạt các biểu hiện khác nhau.

Khi bị Toxoplasmosis, nồng độ IgM kháng thể thường được phát hiện rất sớm trong bệnh nhiễm và cao nhất trong vòng một hoặc hai tháng sau khi khởi phát bệnh. Chúng thường vẫn có khả năng phát hiện chỉ trong vài tuần nhưng có thể tồn tại cho tới chừng 2 năm.

NGUYÊN TẮC XÉT NGHIỆM

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) dựa trên khả năng của chất sinh học (Kháng nguyên) để hấp thụ vào bề mặt nhựa như polystyrene (pha rắn). Khi kháng nguyên liên phủ trên pha rắn được tiếp xúc với huyết thanh bệnh nhân, kháng thể đặc hiệu kháng nguyên, nếu có, sẽ liên kết với các kháng nguyên trên pha rắn tạo thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Tiếp theo, các giếng phải được rửa bỏ những phần còn lại trong mẫu, và thêm vào kháng thể dê kháng IgG người liên hợp horseradish peroxidase để gắn lên phức hợp kháng nguyên kháng thể. Sau khi rửa lần 2, chất tạo màu/cơ chất, tetramethylbenzidine (TMB) được thêm vào. Nếu có kháng thể đặc hiệu kháng nguyên hiện diện trong huyết thanh bệnh nhân, hỗn hợp tạo màu thành màu xanh. Màu xanh chuyển sang màu vàng sau khi cho dung dịch dừng phản ứng enzyme. Kết quả màu chỉ thị nồng độ kháng thể, được đọc bằng mắt hoặc sử dụng máy đọc ELISA.

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM

Đặt số mong muốn vào một khung vi giếng. Để 4 Control (một Negative Control, hai Calibrator và một Positive Control) mỗi lần chạy. Một  giếng trống thuốc thử (RB) cần được chạy trên mỗi xét nghiệm. Kiểm tra phần mềm và đầu đọc yêu cầu cho bố trí control chính xác. Trả lại vi giếng không sử dụng vào túi kín với chất hút ẩm, đóng kỹ và bỏ vào tủ lạnh ngay.

Pha loãng huyết thanh xét nghiệm, control tỷ lệ 1:81(ví dụ: 10 μl + 800 μl) trong Serum Diluent Plus. (Đối với pha loãng thủ công, đề nhỏ Serum Diluent vào ống nghiệm trước và sau đó thêm các huyết thanh bệnh nhân). Trộn đều.

Với mỗi giếng, thêm 100 μl control và huyết thanh bệnh nhân pha loãng thích hợp. Thêm 100 μl Serum Diluent Plus vào giếng trống thuốc thử. Kiểm tra phần mềm và yêu cầu máy đọc cho đúng vị trí giếng trống thuốc thử.

Ủ các giếng ở nhiệt độ phòng (21-25 °C) trong 30 phút.

Hút hoặc đổ chất lỏng ra khỏi tất cả các giếng. Nếu sử dụng thiết bị rửa bán tự động hoặc tự động thêm 250-300 μl Wash Buffer đã pha loãng vào từng giếng. Hút hoặc đổ bỏ tất cả chất lỏng. Lặp lại quy trình rửa hai lần (tổng cộng là ba lần rửa) cho rửa thủ công hoặc bán tự động hoặc bốn lần (tổng cộng là năm rửa) cho các thiết bị tự động. Sau lần rửa cuối cùng, đập ngược khay trên khăn giấy để loại bỏ tất cả các chất lỏng khỏi giếng.

Thêm 100 μl Conjugate vào mỗi giếng, kể cả giếng trống thuốc thử. Tránh tạo bọt vì chúng có thể mang lại kết quả sai.

Ủ các giếng ở nhiệt độ phòng (21-25 °C) trong 30 phút.

Lặp lại bước rửa.

Thêm 100 µL Substrate Solution (TMB) vào từng giếng, bao gồm cả giếng trống thuốc thử, duy trì tốc độ nhỏ giống nhau giữa các giếng.

Ủ các giếng ở nhiệt độ phòng (21-25 °C) trong 15 phút.

Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 100 µL Stop Solutiontheo thứ tự nhỏ Substrate, bao gồm cả giếng trống thuốc thử. Gõ dọc theo khay nhẹ nhàng, để trộn thành phần của giếng. khay có thể để  trong một 1h sau khi bổ sung Stop Solution và trước khi đọc.

Màu tạo ra nên được đọc trên máy đọc khay vi giếng ELISA được trang bị với bộ lọc 450 nm. Nếu bước sóng kép được sử dụng, thiết lập các bộ lọc tham chiếu đến 600-650 nm. Thiết bị nên được tham chiếu với không khí.

Giếng trống thuốc thử có độ hấp thụ ở 450 nm phải ít hơn 0,150. Nếu giếng trống thuốc thử ≥ 0,150 xét nghiệm phải được chạy lại. Tham chiếu máy đọc trên giếng trống thuốc thử và sau đó tiếp tục để đọc toàn bộ khay. Hủy bỏ các khay được sử dụng sau khi đọc.

PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

– ≤ 0,90: Âm tính         

– 0,91-1,09: Nghi ngờ        

–  ≥1.10: Dương tính

Kết luận âm tính hay dương tính trên huyết thanh không có nghĩa hoàn toàn là người đó không nhiễm bệnh ký sinh trùng hay có nhiễm bệnh ký sinh trùng. Kết luận có nhiễm bệnh hay không sẽ do Bác sĩ là người dựa vào lúc thăm khám biểu hiện của người bệnh kết hợp với tất cả các xét nghiệm, rồi mới đi đến kết luận chẩn đoán chính xác có nhiễm bệnh Toxoplasma gondii hay không và quyết định điều trị.

                                                        KTV. HUỲNH HƯƠNG

Tin Liên Quan

Hỗ trợ trực tuyến

028 38 30 23 45

Gọi điện SMS Liên hệ

028 38 30 23 45

Gọi điện SMS Liên hệ